Électrophorèse : étapes pour une série de gels

novembre 9, 2021by Kalstein
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L’électrophorèse est une technique de biologie moléculaire où un courant électrique contrôlé est utilisé pour séparer les biomolécules en fonction de leur rapport taille/charge électrique, en utilisant une matrice gélatineuse (gel) comme base.

L’une des utilisations courantes de cette technique réside dans la réalisation de ce qu’on appelle l’électrophorèse d’ADN qui peut être réalisée dans des gels d’agarose ou de polyacrylamide. Tous deux ont des caractéristiques différentes au niveau de leurs propriétés et de leur mode de préparation, c’est pourquoi l’un ou l’autre sera utilisé en fonction de l’application et des objectifs à poursuivre. L’électrophorèse sur gel d’agarose est la méthode standard pour séparer et purifier les fragments d’ADN lorsqu’un pouvoir de résolution élevé n’est pas requis. Pour sa part, l’électrophorèse sur gels de polyacrylamide, bien qu’elle présente une plus grande limitation en termes de taille des fragments que l’on peut séparer (5-600 pb), a un pouvoir de résolution beaucoup plus élevé, permettant la séparation de molécules qui diffèrent dans un seule paire de bases. Les gels de polyacrylamide coulent verticalement et ont l’inconvénient d’être plus compliqués à fabriquer et à manipuler.

Dans cet article, nous allons nous concentrer sur les étapes pour effectuer une électrophorèse d’ADN sur des gels d’agarose :

Préparation du gel d’agarose

  • Peser la quantité d’agarose nécessaire pour obtenir la concentration désirée en fonction du volume de gel.
  • Ajouter l’agarose au tampon (TAE 1x ou TBE 0.5x) dans un flacon.
  • Chauffer le mélange dans un four à micro-ondes jusqu’à ce que tout l’agarose ait fondu.
  • Laisser refroidir la solution d’agarose à une température d’environ 50 °C.
  • Pendant que la solution d’agarose refroidit, préparez le moule dans lequel sera réalisé le gel en scellant les bords avec du masking tape, ou en le plaçant dans le dispositif prévu à cet effet, et en plaçant le peigne dans la position souhaitée.
  • Versez délicatement la solution d’agarose sur le moule plat et laissez-la se solidifier pendant au moins 30 min.

La préparation des échantillons

  • Mélanger les échantillons d’ADN et le marqueur de taille avec 0,2 volume de tampon de chargement 6x. Le volume total sera déterminé par la taille des puits, généralement de 15 à 30 µl.

Chargement des échantillons et analyse du gel

  • Une fois le gel solidifié, retirer le joint des bords et placer le moule avec le gel dans la chambre d’électrophorèse.
  • Ajouter du tampon d’électrophorèse (TAE 1x ou TBE 0,5x) jusqu’à ce que le gel couvre environ 3 à 5 mm.
  • Retirez délicatement le peigne pour libérer les puits d’échantillon.
  • Chargez dans les puits les échantillons qui ont été préparés à l’étape 7.
  • Connectez les câbles à l’alimentation et appliquez une tension de 20-150 V (1-5 V/cm selon la distance entre les électrodes). Le réglage de la tension est très variable en fonction de la chambre et des tailles à séparer, des tensions pas très élevées sont recommandées pour les très grandes tailles d’ADN.
  • Faites couler le gel jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol se trouve à une distance des bords d’environ 25 % de la longueur totale du gel. A ce moment-là, l’électrophorèse doit être arrêtée.

Coloration sur gel et visualisation de l’ADN

  • Si le bromure d’éthidium n’a pas été ajouté au gel, le gel doit être coloré une fois l’électrophorèse terminée. Pour ce faire, le gel est démoulé et plongé dans une solution de bromure d’éthidium (0,5 µg/ml) pendant au moins 15 min.
  • Placer le gel sur un transilluminateur et allumer la lampe à lumière ultraviolette (λ ≈ 300 nm), l’ADN sera visualisé sous forme de bandes orange.
  • Photographier le gel avec le système photographique disponible.

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