Un thermocycleur est un équipement de laboratoire qui permet de réaliser la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de manière efficace et rapide, grâce à l’exécution automatique et cyclique des changements de température nécessaires à l’amplification d’une chaîne d’acide désoxyribonucléique (ADN) , à partir d’une enzyme thermostable. La PCR permet d’amplifier plusieurs fois de manière exponentielle un petit nombre de molécules d’ADN.
Le protocole de cette technique repose sur la synthèse de plusieurs fois d’un fragment d’ADN à l’aide d’une enzyme polymérase pouvant fonctionner à très haute température, puisqu’elle provient de la bactérie Thermus aquaticus qui vit à haute température (79°C à 85°C), connue comme taq polymérase.
Lorsque nous faisons une réaction PCR, nous simulons ce qui se passe à l’intérieur de la cellule lorsque l’ADN est synthétisé et tous les ingrédients nécessaires pour le faire sont mélangés dans le tube : la polymérase, l’ADN de l’organisme que nous voulons étudier, les oligonucléotides (amorces, initiateurs, amorces) nécessaires au démarrage de la transcription, les dinucléotides (dNTP) et les conditions pour que l’enzyme fonctionne correctement (un certain pH, certaines quantités de magnésium sous forme de MgCl2, KCl et d’autres sels ou réactifs peuvent être nécessaires, selon chaque polymérase). Cette technique a de nombreuses applications différentes et est devenue un outil très important en biologie moléculaire ; Ses applications vont de la génétique des populations, de l’évolution moléculaire et génomique à la médecine légale.
Comment fonctionne la technique PCR ?
Si nous avons déjà les tubes avec tout le nécessaire pour que la synthèse du fragment qui nous intéresse soit réalisée (taq polymérase, dinucléotides, ADN, eau, tampon avec magnésium et autres sels, et oligonucléotides). L’étape suivante consiste à placer les tubes dans le thermocycleur, qui sert essentiellement à les chauffer ou à les refroidir à des températures très précises.
Comment se fait-il que le fragment d’ADN que nous voulons soit amplifié ?
Le thermocycleur chauffe ou refroidit les tubes à trois températures différentes, qui se répètent encore et encore (appelées cycles de réaction), la première est à 95°C (dénaturation) pendant laquelle les doubles brins d’ADN sont ouverts ou dénaturés, restant sous forme de chaînes simples; Après que le thermocycleur a ajusté la température dans un intervalle compris entre 40 °C et 60 °C (alignement), à cette température les liaisons hydrogène entre les oligonucléotides et l’ADN sont constamment formées et rompues, et les liaisons plus stables (celles qui sont complémentaires ) durera plus longtemps, laissant les oligonucléotides « alignés » formant une petite région double brin. La polymérase se lie à ce petit morceau d’ADN double brin).
La polymérase se lie à ce petit morceau d’ADN double brin et commence à se copier dans le sens 5′ vers 3′ ; En ajoutant quelques bases supplémentaires, les liaisons hydrogène qui se forment entre les bases stabilisent davantage la liaison et l’oligonucléotide reste à ce site pour l’étape suivante. Ensuite, la température monte à 72°C (étape dite d’extension), puisque 72°C est la température à laquelle la polymérase atteint son activité maximale, et la synthèse des fragments d’ADN se poursuit à partir des oligonucléotides qu’ils avaient déjà alignés. .
Dans le premier cycle, avec ces trois températures, les premiers fragments seront formés à partir de l’ADN génomique. Ensuite, les trois températures sont répétées une fois de plus, mais dans ce deuxième cycle, les oligonucléotides, en plus de se lier à l’ADN que nous avons mis au début, se lieront également aux fragments nouvellement synthétisés du premier cycle, donc, dans ce second étape la polymérase va synthétiser deux longs fragments copiés directement à partir de l’ADN et deux fragments de la taille attendue, qui est la taille entre les deux oligonucléotides que nous avons utilisés. De cette façon, à chaque cycle, le nombre de fragments de la taille souhaitée augmentera.
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