Thermocycleur : Comment travaillez-vous ?

novembre 3, 2021by Kalstein
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Un thermocycleur ou aussi appelé séquenceur thermique est un équipement de laboratoire qui permet de réaliser l’amplification de molécules d’ADN au moyen de la technique PCR (Polymerase Chain Reaction), par des changements cycliques de températures qui génèrent à leur tour une amplification de brin de cet acide nucléique. . Cet équipement est utilisé pour des amplifications qualitatives ou encore pour quantifier la quantité d’ADN amplifié.

La technique PCR se déroule selon un processus automatique et peut être complété en quelques heures seulement. Ce processus est entièrement piloté par le thermocycleur, qui est programmé pour changer la température de réaction toutes les quelques minutes, rendant possible la dénaturation et la synthèse d’ADN.

Cette technique peut être divisée en deux grandes catégories :

  • PCR pour l’amplification d’un site unique connu du génome (locus) : Dans ce type de PCR, il est nécessaire de connaître la séquence sur laquelle on travaille, et à travers elle il est possible de faire des phylogénies.
  • PCR dans laquelle il n’est pas nécessaire de connaître la région en cours d’amplification (des régions inconnues sont amplifiées, comme des zones hypervariables du génome), donc la taille des fragments à attendre n’est pas connue. Il est utilisé pour déterminer le polymorphisme génétique.

Comment est fabriqué un thermocycleur ?

Un thermocycleur est généralement constitué d’un bloc de résistance électrique qui distribue une température homogène (entre 4 °C et 96 °C) à travers une plaque pendant un temps programmable. Dans certains équipements, la résistance électrique a été remplacée par la technologie Peltier (semi-conducteurs), qui permet une plus grande homogénéité en température.

Vous devez garder à l’esprit que le thermocycleur utilisé dans la PCR en point final n’est pas le même que celui utilisé pour une PCR en temps réel, car ce dernier doit détecter la fluorescence et dans différents canaux d’absorption.

Fonctionnement d’un thermocycleur

Le fonctionnement d’un thermocycleur repose sur l’exécution de trois étapes importantes au cours de la technique PCR. La première étape est la dénaturation, qui se produit au cours du premier cycle. De là, il passe aux cycles suivants pour séparer les brins formés. Pendant que cela se produit, la température oscille entre 94 et 98 º C. Ce processus dure au moins 10 secondes. Rappelons que la structure de l’ADN est double brin, de sorte que, grâce à cette étape, la séparation du double brin est obtenue, en brins séparés.

La deuxième étape consiste en l’alignement des amorces dans le brin de la matrice à amplifier. Cette étape dure environ 20 secondes et ici le thermocycleur ajuste la température entre 40°C et 60°C, à cette température les liaisons hydrogène entre les oligonucléotides et l’ADN sont constamment formées et rompues, ainsi que les jonctions les plus proches. durent plus longtemps, les amorces étant alignées formant ainsi une petite région double brin. Cela se produit car cela dépend surtout des amorces utilisées dans cette opération.

La troisième étape est l’allongement du double brin de 20 paires qui a été créé à l’étape précédente, par l’union de la polymérase qui commence à copier dans le sens 5′ à 3′, en ajoutant quelques bases supplémentaires, et en formant de l’hydrogène ponts entre les bases. Atteindre dans cette étape une température de 72°C, qui est la température optimale ou la plus forte activité de la polymérase, qui poursuit la synthèse des fragments d’ADN à partir des amorces alignées.

Après cette étape, il est très probable que vous reveniez au premier de 98°C pendant environ 10 secondes, puis répétiez le cycle entre 30 et 45 fois de plus. Après ces 3 étapes, une étape supplémentaire de chaleur est ajoutée, au moins 72 degrés pendant au moins 7 minutes. Ceci est nécessaire pour pouvoir ré-emboîter les brins d’ADN des amorces et de la polymérase. Par la suite, une diminution de température de 15 et 4 °C se produit afin de maintenir l’échantillon en parfait état jusqu’au moment où il est nécessaire.

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