Comment préparer un homogénat ?

septembre 6, 2021by Kalstein
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Le mélange brut de cellules détruites est connu sous le nom d’homogénat. Lors de la centrifugation d’un homogénat cellulaire, les plus grosses particules sédimentent plus rapidement que les petites, ce qui permet d’obtenir des fractions brutes d’organites par centrifugation différentielle.

La première étape de tout processus analytique dans lequel le contenu cellulaire doit être libéré, consiste en l’homogénéisation des tissus et la rupture de la cellule. Cela nous fournit un mélange brut qui peut être utilisé comme matériau de départ dans des processus analytiques, ou pour la détermination d’activités enzymatiques ou d’études métaboliques lorsque l’incorporation d’un certain métabolite par un tissu intact est difficile. Nous pouvons également utiliser d’autres tissus homogénéisés pour la séparation des composants cellulaires (fractionnement cellulaire), dans des expériences de compartimentation métabolique (détermination dans quelle partie de la cellule se produit un processus ou une voie métabolique).

De quoi faut-il tenir compte lors de la préparation d’un homogénat ?

Le matériel biologique à homogénéiser doit être sélectionné de manière à ce qu’il soit riche en organites d’intérêt, et également très actif dans la voie métabolique à étudier.

Par exemple, si l’on veut étudier la chaîne respiratoire, on sélectionnera un tissu riche en mitochondries, comme le foie frais. Si nous voulions isoler des noyaux, nous prendrions un morceau de thymus. Il faut aussi prendre des précautions particulières pour que la solution dans laquelle s’effectue l’homogénéisation soit isotonique (généralement des solutions de saccharose). Le fractionnement cellulaire se fait par centrifugation différentielle (à différentes vitesses et pour différents temps), il est ainsi possible de séparer noyaux, chloroplastes, lysosomes, mitochondries, microsomes. Le contenu en cytosol reste dans le surnageant de la dernière centrifugation.

De nombreuses enzymes et protéines sont thermolabiles (elles sont dénaturées par l’action de la température) donc ces processus d’homogénéisation doivent être réalisés à froid (généralement à 4°C dans les chambres froides).

Quelles méthodes utiliser pour préparer un homogénat?

Les méthodes utilisées pour la disjonction cellulaire sont principalement basées sur le fait que les cellules cultivées sont généralement faciles à rompre. Ceci est obtenu par choc osmotique, cycles de gel-dégel ou par digestion avec des enzymes (protéases et lipases).

Une autre façon de casser les cellules animales est le cas des solvants organiques tels que le toluène. cependant, les cellules de levure et de plante ont une paroi cellulaire dure et résistante qui nécessite une combinaison de méthodes enzymatiques et mécaniques pour la briser. Les méthodes enzymatiques impliquent le traitement des cellules végétales avec des pectinases et des cellulases. Dans le cas des levures, sa paroi est brisée avec du lysozyme (un mélange d’enzymes).

Parmi les méthodes physiques nous avons :

  • Broyage au mortier (en présence d’un agent abrasif tel que l’alumine).
  • Agiter en présence de petites billes de verre (il est très utilisé chez les levures, mais chez les plantes les organites peuvent être endommagés).

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