La génétique a traditionnellement été une discipline qui s’est focalisée sur l’analyse de la variation héréditaire ; ces variantes génétiques ont servi de support (comme marqueurs dans la cartographie génétique ou dans des études de population) ou de fin (études de structure/fonction de type sauvage contre mutants).

L’avènement des techniques de clonage moléculaire et d’ADN recombinant, comme le transfert Southern, a permis l’analyse de la variation de la séquence d’ADN et a marqué une nouvelle ère dans la génétique moléculaire. L’introduction de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), une méthode in vitro d’amplification enzymatique de segments d’ADN spécifiques à partir d’un génome complexe, a considérablement simplifié l’étude de la variation des séquences et, par conséquent, transformé la manière dont l’analyse génétique peut être effectuée.

L’amplification par PCR d’un segment d’ADN spécifique à partir d’ADN génomique ou d’ARN, après transcription inverse, peut remplacer la construction de bibliothèques génomiques pour de nombreuses applications et, dans d’autres, peut grandement faciliter les procédures ultérieures, telles que :

• Clonage.
• Séquencement.
• Hybridation de sondes d’oligonucléotides.
• Analyse des sites de restriction.

D’autre part, la disponibilité d’instruments de séquençage automatisés promet que l’analyse des séquences de produits PCR ne sera pas seulement une procédure de recherche critique, mais qu’en fin de compte, elle peut également être utilisée dans un contexte de diagnostic clinique, pour diverses maladies d’origine génétique.

Avantages de l’utilisation de la PCR dans la caractérisation génétique

En plus de simplifier de nombreuses procédures et donc de permettre l’utilisation de techniques moléculaires dans une grande variété de disciplines biologiques, la PCR a permis de nouvelles approches pour l’analyse génétique basées sur la capacité d’amplifier de très petits échantillons (par exemple la cartographie des spermatozoïdes). L’utilisation d’un test PCR pour déterminer le génotype d’un échantillon d’ADN présente plusieurs avantages :

• L’essai ne prend que quelques heures par rapport au transfert Southern, qui peut prendre des jours ou des semaines.
• La PCR est capable de s’automatiser, ce qui permet de caractériser rapidement de grandes quantités d’échantillons avec peu de main-d’oeuvre requise.
• La PCR est peu coûteuse en ADN ; seuls des picogrammes ou des nanogrammes sont nécessaires, tandis que des nanogrammes ou des microgrammes sont nécessaires pour le transfert Southern de l’ADN génomique.
• Dans une réaction de PCR, de nombreux loci génétiques différents peuvent être caractérisés en même temps par amplification multiple en utilisant plusieurs paires d’amorces.

En conséquence de ces économies, plusieurs laboratoires ont converti des marqueurs de RFLP connus en un format PCR et de nombreuses recherches de nouveaux polymorphismes se sont concentrées sur ceux qui peuvent être testés par PCR. L’exigence la plus fondamentale pour l’analyse par PCR est un ensemble d’amorces flanquant une région d’ADN polymorphe spécifique. Une fois qu’un produit PCR spécifique a été amplifié, différentes procédures peuvent être utilisées pour déterminer le génotype d’un échantillon.

Analyse des séquences d’ADN des produits amplifiés par PCR

La caractérisation la plus complète d’un produit PCR est la détermination de la séquence de nucléotides ; c’est la manière la plus sensible de révéler le polymorphisme. Bien que l’analyse de séquence d’ADN amplifié ait été initialement réalisée sur des produits clonés de PCR, l’augmentation de la spécificité a fait du séquençage direct des produits de PCR l’approche privilégiée pour la plupart des applications.

Le séquençage direct évite les problèmes potentiels associés à des bases rares mal intégrées (plusieurs clones doivent être séquencés pour détecter les artefacts de PCR rares tels que l’incorporation erronée) mais, dans l’amplification de familles de gènes multiples ou d’échantillons hétérozygotes complexes, le clonage est souvent utile pour séparer les différents allèles ou loci.

Le séquençage de terminaison de chaîne est effectué avec des amorces marquées (radioactives ou fluorescentes), des DNTP marquées ou des terminaisons de désoxydes marquées. Les moules monocaténaires peuvent être générés en utilisant une PCR asymétrique, une approche dans laquelle l’un des deux amorces est limitante, ou en utilisant une amorce biotinylé de sorte qu’un brin de produit de PCR peut être capturé par une perle de streptavidine.

L’utilisation d’ADN polymérases thermostables a permis l’approche de séquençage par cycles, dans laquelle des cycles répétés d’extension et de dénaturation entraînent une accumulation linéaire de produits d’extension d’amorces qui augmentent la sensibilité de la réaction de séquençage. Les moules bicaténaires peuvent être facilement séquencés car la réassociation des chaînes du moule est réduite au minimum.

Les thermocycleurs de Kalstein pour la réalisation de la PCR

Les réactions de PCR sont effectuées sur un thermocycleur, qui effectue les cycles de chauffage pour que la dénaturation, l’alignement et l’allongement de la chaîne se produisent. Les thermocycleurs du fabricant Kalstein intègrent les dernières technologies dans le domaine, générant des instruments très robustes, avec une grande précision dans le contrôle de la température et travaillant avec un faible niveau de bruit et une faible consommation d’énergie. Les prix, les devis et les achats peuvent être consultés sur le site ICI ou sur le site ICI.