Enzymologie de la réaction en chaîne de polymérase

novembre 25, 2022by Kalstein
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La PCR (réaction en chaîne par polymérase) est un doublon artificiellement induit de séquences d’ADN délibérément sélectionnées. Dans ce cas, les séquences dupliquées sont de nouveau utilisées comme modèle pour les doublons supplémentaires, de sorte qu’un nombre exponentiellement croissant de doublons est obtenu à partir d’une séquence de sortie.

La PCR peut être utilisée pour fournir des preuves au niveau génétique, par exemple pour résoudre des délits (empreinte génétique), pour détecter des maladies héréditaires, des infections virales ou pour clarifier les relations familiales (tests de paternité, arbres généalogiques). Un inconvénient de cette méthode est qu’il n’est pas possible de répliquer des brins d’ADN entiers, mais seulement des sections courtes (jusqu’à un maximum de 40 kilopairs de bases (kpb), soit 40 000 paires de bases). Pour effectuer une PCR, les éléments suivants sont nécessaires :

  • La séquence de départ de l’ADN à examiner (moule, Engl. Modèle).
  • Deux amorces créées artificiellement (construites) comme points d’accouplement pour la polymérase.
  • ADN polymérase résistant à la chaleur (généralement appelé polymérase Taq, une enzyme résistante à la chaleur de la bactérie Thermus aquaticus qui vit dans les geysers).
  • Une solution qui contient, entre autres, les bases nécessaires (triphosphates de désoxyribonucléosides) en tant que blocs de construction et fournit un environnement de travail adapté à la polymérase (solution tampon).
  • Un dispositif adéquat qui génère les températures requises pour les étapes individuelles (thermocycleur).

Pour que cette réaction chimique se déroule dans des délais raisonnables, il faut employer des enzymes qui, en plus d’accélérer la rapidité de la réaction, doivent être stables dans les conditions de travail. En ce sens, la Taq polymérase, comme vous le verrez, a représenté un grand pas en avant. D’autre part, d’autres enzymes sont également utilisées à d’autres fins qui augmentent la puissance des études génomiques.

L’importance de la Taq polymérase dans la PCR

La PCR a eu ses problèmes au début. Par exemple, un ADN polymérase thermiquement instable a été utilisé pour l’allongement et cette nouvelle enzyme a dû être ajoutée après chaque étape de dénaturation. En outre, trois bains d’eau avec des températures différentes ont été utilisés. Pour une PCR de 30 cycles, cela signifiait ajouter l’enzyme 30 fois et le convertir 90 fois.

Les progrès méthodologiques ont été publiés en 1988, lorsque la polymérase Taq a été introduite. L’enzyme thermostable a survécu à la dénaturation et n’a pas dû être rajoutée après chaque cycle. La spécificité, la sensibilité de détection et les performances ont également été améliorées. Grâce à la polymérase Taq, la PCR a pu être automatisée et les premiers thermocycleurs ont été mis sur le marché à la fin des années 1980.

La polymérase Taq reste une enzyme populaire. Il a été isolé du thermophile aquatique épris de chaleur, qui vit près des eaux thermales et des geysers. La température d’extension optimale de l’enzyme est comprise entre 75 ° et 80 ° C et a une demi-vie de 10 minutes à 97 ° C. Si l’enzyme est ajoutée seulement après la première étape de dénaturation plus longue, la durée de vie et l’activité sont considérablement prolongées. La réduction de la température de dénaturation à 95 ° C a le même effet.

En outre, elles peuvent compenser une baisse de l’activité par un allongement de la durée de la phase d’allongement. La Taq a une vitesse d’extension de 2 à 4,5 kilobases par minute et, bien sûr, il fait des erreurs. On dit qu’une erreur se produit en moyenne toutes les 4 200 bases, mais de nombreuses publications montrent que seulement toutes les 10 000 à 125 000 bases contiennent un nucléotide incorrect.

Quelles sont les applications des enzymes de restriction dans les études génomiques ?

Les enzymes de restriction sont des outils importants en biologie moléculaire classique et moderne. Les enzymes de restriction, également des endonucléases de restriction, reconnaissent des séquences d’ADN spécifiques, puis coupent l’ADN directement sur le site de reconnaissance ou à une distance définie. Les enzymes de restriction sont traditionnellement utilisées en biologie moléculaire pour le clonage. Ici, la digestion de l’ADN par les enzymes est utilisée pour produire des extrémités d’ADN compatibles. Ces extrémités sont alors reliées par un ADN ligase.

L’ADN à cloner peut-être très différent, de l’ADN génomique à l’ARNm transcrit en ADNc, en passant par un gène préalablement cloné qui doit se déplacer d’un vecteur à un autre (sous-clonage). Les enzymes de restriction peuvent également être utilisées pour créer des points de terminaison compatibles pour les produits PCR. Dans tous les cas, une ou plusieurs enzymes de restriction sont utilisées pour digérer l’ADN, ce qui permet une insertion non ciblée ou ciblée dans le plasmide compatible.

Les thermocycleurs de Kalstein comme support de la recherche en biologie moléculaire

Toutes les études impliquant de petits échantillons d’ADN et nécessitant leur multiplication, il faut recourir à la méthodologie de la PCR, qui est elle-même supportée dans un thermocycleur. Kalstein est un fabricant d’équipements de haute qualité dans ce secteur, et ses thermocycleurs, ont comme caractéristiques principales sa robustesse pour un travail prolongé, le refroidissement par technologie Peltier et une interface qui facilite leur manipulation. L’achat de ces équipements, leurs prix et devis, est disponible sur les pages ICI et ICI.

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